氧化还原代谢共享资源设施(RM SRF)

氧化还原代谢共享资源设施(RM SRF)的任务是为马基癌症中心(MCC)的基础研究、临床前研究和临床研究人员提供氧化还原代谢、氧化应激、线粒体功能、蛋白质组学和代谢组学方面的专业知识和服务。

癌细胞表现出自由基生物学增加和代谢改变。通常这些变化表现为氧化应激标记物升高，线粒体和细胞代谢改变，由于蛋白质进行代谢过程，通过差异蛋白表达和/或翻译后修饰。后者包括特定的氧化修饰和表观遗传修饰。

为了研究氧化还原代谢的这些综合方面，RM SRF执行四项主要服务:

1. 氧化应激和亚硝化应激标记物的分析
2. 基于海马fx的线粒体功能和糖酵解分析
3. 蛋白质组学或氧化还原蛋白质组学对蛋白质表达或氧化或共价修饰蛋白的分析
4. 剖面和稳定同位素分解代谢组学(SIRM)

联系Tomoko Sengoku博士，RM SRF实验室经理，通过iLab进行初步咨询。在这次咨询会上，仙谷医生会引导你找到合适的服务组件，帮助你开始。点击下面的链接可以直接进入RM SRF iLab登陆页面，其中有更详细的说明和一次性帐户设置。一旦你的账户建立了，iLab将使您能够提交RM SRF服务请求，提供所需的批准，并监视项目的进展。

自由基和代谢改变的作用在癌症生物学和癌症治疗的各个方面越来越明显。分析自由基在癌症生物学中的作用需要高度熟练的能力:

• 测量与不同癌症相关的各种组织、细胞和液体中自由基引起的损伤。
• 测量负责自由基产生、氧化清除和自由基损伤的分子。
• 使用蛋白质组学来识别组织、细胞和液体中具有不同水平或已被氧化修饰的蛋白质。
• 测量线粒体功能，因为线粒体是细胞中自由基的主要来源。
• 提供关于改变的代谢物，酶，癌症和后续癌症治疗途径的代谢信息。

RM SRFs代谢组学组件的一个基本基石是生物实验期间的稳定同位素标记，这意味着实验设计必须与分析和信息学相结合。正因为如此，一个简单的收费服务模式不太可能为癌症研究人员带来非常有用的结果，而代谢组学服务的结构是为了广泛的建议和合作。

重要的是，在美国这个地区，RM SRF是世界上仅有的几个癌症中心常驻资源之一，拥有必要的知识和试剂，为MCC成员提供所需的氧化还原和代谢服务。RM SRF的人员非常了解自由基、氧化应激、代谢、样品处理和制备，以及所采用的每种测定方法的优点和局限性，包括生物能量学、代谢组学和蛋白质组学。

稳定同位素分解代谢组学资源中心(RC-SIRM)位于环境与系统生物化学中心(CESB)，是由NIH共同基金支持的六个代谢组学中心之一。MCC的研究人员也可以利用TEC生物科学公司，这是一家位于列克星敦的初创生物技术公司，位于英国校园。beplay苹果下载网址TEC生物科学公司提供以下代谢组学服务:稳态代谢组学、动态代谢组学和脂质分析。这些独特的投资为MCC研究人员在样本使用、分析和结果解释方面提供了明显的优势。

如果多个主要调查者(pi)要求同时进行分析，RM SRF领导决定优先级基于以下标准:

• 第1级:来自NCI资助的MCC成员或联邦资助的癌症相关同行评审研究的样本
• 第2级:来自MCC研究人员准备的癌症相关的、同行评审的拨款申请的样本
• 第3级:来自MCC试点研究资助的癌症相关项目的MCC研究人员或非同行评审来源的样本
• 第4级:没有资金的MCC调查人员的样本，他们的分析将导致初步数据和随后提交校外提案的可能性
• 第5级:非mcc调查人员的样本。

研究人员必须在使用氧化还原代谢服务或通过RM SRF接收的信息所产生的任何出版物中确认马基癌症中心氧化还原代谢共享资源设施(RM SRF)。为方便起见，欢迎您使用以下声明。如果RM SRF提供了任何智力投入或额外努力，请包括他们的名字。

该研究得到了肯塔基大学马基癌症中心氧化还原代谢共享资源设施(P30CA177558)的支持。beplay全站官网登录入口

RM SRF可以随时在线联系，一天24小时，通过iLab．

形式

在RM SRF开始工作之前，研究人员需要通过iLab完成RM SRF在线样本提交表和RM SRF生物安全问卷。两种表单都可以通过访问iLab页面来访问。

如果您在向iLab提交服务请求时遇到任何问题，请联系迈克尔先生Alstott故障排除。

注意:在iLab提交表格中没有研究员账号和授权，RM SRF服务不能启动。

RM SRF主要服务(按服务收费)

服务1:氧化应激和亚硝化应激标记物分析。总蛋白氧化和脂质过氧化测定($60/每氧化修饰/每膜使用)。

• 蛋白质氧化指标(蛋白质羰基和3-硝基酪氨酸)。
• 脂质过氧化指数(蛋白结合的4-羟基-2-反式壬烯醛，HNE)。
• DNA或RNA氧化指数(分别为8-羟基-2脱氧鸟苷或8-羟基-2鸟苷)。
• 抗氧化酶活性及水平分析。
• 还原性和氧化性谷胱甘肽(GSH/GSSG)和NAD的分析⁺/ NADH、辅酶ii⁺/ NADPH。
• 对四个MCC研究项目中使用这些指标的结果的解释和建议

服务2:生物系统的分子生物学操作，用于研究氧化还原信号，包括线粒体功能的测量。海马96井分析(140美元/样品板)。海马8井分析($70/样品板)。氧化还原信号的分子生物学操作($60/样品)。氧化还原酶的测定($15/样品)。

• 海马生物科学的仪器分析，利用微量滴定板平台同时监测完整细胞的耗氧量和pH值的变化(例如，促进化疗的剂量反应研究)。
• 编码初级抗氧化酶的cDNA探针。
• 将氧化还原相关蛋白(包括那些调节细胞氧化还原状态、清除自由基和修复氧化/亚硝化损伤的蛋白)稳定和短暂转染到细胞内。

服务3:蛋白质组学对蛋白质的鉴定。蛋白质组学或氧化还原蛋白质组学对蛋白质表达或氧化或共价修饰蛋白的分析。MCC为MCC成员提供40%的蛋白质组学服务补贴。例如，使用Orbitrap的LC-MS/MS分析蛋白质修饰的MCC会员是90美元，而不是150美元。为了遵守大学的政策，所有用户都应该被收取相同的费用，MCC为这项分析提供60美元的补贴。MCC的承诺将使研究人员能够在他们的癌症研究项目中利用最先进的技术。

• 蛋白质组学鉴定在相关系统中具有差异表达、恭顺氧化修饰或差异共价修饰的蛋白质:蛋白质分离、消化和在orbitrap MS仪器上对胰蛋白酶肽进行ESI-MS/MS序列分析。
• 成像软件介导的蛋白质测定待评价。
• 斑点切除和蛋白质消化。
• 数据库查询以识别蛋白质。
• 用Western blotting或其他方法验证鉴定结果。
• 氧化修饰蛋白的功能分析(也可用于其他翻译后修饰)。
• 氧化还原信号通路中蛋白质-蛋白质相互作用的分析(也可应用于其他信号通路)。
• 从蛋白质氧化调节的途径和功能的角度解释结果。

服务4:代谢组学(通过CESB)。执行两大类代谢组学服务:“分析”和稳定同位素分解代谢组学(SIRM)。分析是指有目标或无目标的实验设计，以确定分析平台(如不同类型的质谱或核磁共振)中特征的数量或样品中化合物的身份和数量。SIRM能够同时定量分析许多代谢“途径”和通量，这些途径与发生在癌症中的代谢重编程特别相关，包括能量生产、增殖所需的合成代谢途径和包括氧化应激代谢在内的生存途径。

代谢组学服务和费率的详细列表可以在http://bioinformatics.cesb.uky.edu/bin/view/RCSIRM/ServicesAndRates

代谢组学(通过TEC Biosciences Inc.)提供三个主要服务:稳态代谢组学提供来自7个代谢途径的超过100种分析物，动态代谢组学分析40种独特的代谢物，在稳定同位素标记后，脂质分析脂肪酸甲酯的酰基链4-24个碳原子长度。

服务选择指引

在您与Sengoku博士的初步咨询中，我们将通过iLab安排，对您的特殊需求和哪些服务是必要的进行评估。

如果需要1号服务或2号服务，Sengoku博士将带您到227 HSRB的RM SRF设施，他或Alstott先生将与您一起工作。

如果您对服务3(蛋白质组学)感兴趣，Sengoku博士将引导您到负责研究的副总裁办公室的蛋白质组学核心。

如果您对第四服务(代谢组学)感兴趣，仙谷博士将为您介绍Rick Higashi博士(rick.higashi@uky.edu）.

在联系东硕博士之前，调查人员应该开始准备讨论以下问题:问题是什么;什么是实验系统?为什么?哪些信息已经可用;以及海马分析是否适合进行。一旦研究者有了这些问题的答案，他们应该联系环境与系统生物化学中心(CESB)的四位主任之一，开始咨询如下所列。像RM SRF的所有组成部分一样，代谢组学组成部分在充电的基础上运行。数据分析通常需要消耗90%的代谢组学劳动，因此MCC研究人员应该在考虑到这一点的情况下准备好讨论时间框架和成本结构。

• 东健博士(rick.higashi@uky.edu)， RM SRF代谢组学部副主任，RC-SIRM主任
• 范丽珊博士(twmfan@gmail.comCESB主任)
• 李国贤博士(andrew.lane@uky.edu)， CESB NMR总监

参观CESB网站额外的信息。

辅助服务(免费)

此外，RM SRF还提供以下辅助服务:

• 向Sengoku博士咨询服务评估、氧化应激和海马XF分析实验的设计和解释，指导研究人员根据需要研究RM SRF的蛋白质组学或代谢组学成分。
• 教育MCC调查人员如何防止人为结果，从而获得可靠和准确的数据。请通过iLab与Sengoku医生预约https://ukmcc.ilabsolutions.com/service_center/show_external/3590/
• 为海报、论文和拨款撰写技术描述、结果部分和讨论段落。通过提供技术信息或初步数据，协助研究人员研究拨款提案和手稿。
• 提供氧化应激指标、海马技术、蛋白质组学和代谢组学协议模板。
• 追求表达和氧化还原蛋白质组学的新应用，以识别癌症界面的其他蛋白质翻译后修饰(如甲基化、乙酰化)。

氧化/亚硝化应激的测量
RM SRF对总氧化应激和/或亚硝化应激提供高度敏感(ng of protein)的免疫化学分析．巴特菲尔德博士发表了大量关于验证这种方法评估整体氧化应激的文章。如果MCC调查人员需要，可以用荧光或高效液相色谱法测定氧化还原谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽，NAD(P)H和NAD(P)⁺采用高效液相色谱电化学检测法测定。在极少数情况下，得到的结果不明确的情况下，将使用基于质谱的蛋白质羰基检测来验证免疫化学方法或使用LC-MS分析细胞氧化还原状态的小分子标记。

线粒体生物学
在氧化/亚硝化应激条件下发生的线粒体变化的几个指标是使用最先进的Seahorse技术进行的。Sengoku博士和Alstott先生都接受过海马仪器的使用训练。Warburg效应是一种通过糖酵解而不是通过癌细胞中的线粒体电子传递链产生能量的优势。它可以很容易地确定完整的细胞使用96孔海马仪器，以确定氧化/亚硝化应激的细胞后遗症。该平台允许使用线粒体生物学作为终点进行剂量反应研究。测定外源性和内源性脂肪酸的利用也可以使用XF分析仪进行调查。

表达蛋白质组学
鉴别具有差异表达的蛋白质对于联系癌细胞中的基因和蛋白质一致性以及帮助识别可能在癌症中起作用的关键转录因子是很重要的。表达蛋白质组学是在RM-SRF中使用反相蛋白阵列(RPPA)进行的，RPPA是一种先进的高通量定量蛋白质组学技术，与SIRM兼容(见下文)，而所有基于质谱的蛋白质组学都不与SIRM兼容。RM-SRF拥有世界上最全面的RPPA覆盖中心代谢，这是代谢重编程癌症的标志。了解更多有关我们蛋白质组学的核心设施．

氧化蛋白的氧化还原蛋白质组学鉴定
一个关键的RM SRF服务，氧化还原蛋白质组学，起源于巴特菲尔德实验室。主要的氧化还原蛋白质组学方法包括鉴定含有过量蛋白质羰基、3-硝基酪氨酸或蛋白结合HNE的蛋白质。鉴别含有过量半胱氨酸残基亚硝基化的蛋白质也是可行的。一旦被识别出来，这些氧化修饰的蛋白质被放置到它们各自的分子通路中，以确定氧化功能失调蛋白质的细胞后果，并在癌症中提供新的重要研究。此外，用于氧化还原蛋白质组学的胰蛋白酶肽的MS/MS序列分析允许识别存在氧化修饰的氨基酸。

蛋白质组学识别共价修饰的蛋白质
乙酰化和甲基化是蛋白质的两种主要共价修饰，与癌症有显著相关性。乙酰化或甲基化蛋白质的蛋白质组学鉴定是RM SRF的一个重要工具。

代谢组学
“代谢组学”是一种技术手段，通过识别和量化一个细胞中存在的所有代谢物的很大一部分，以及它们如何随着相关代谢网络的扰动而变化来分析代谢。“代谢组学”不是“新陈代谢”的同义词，因为完全有可能进行代谢组学分析而不获得任何关于新陈代谢的见解、发现或理解。

代谢组学需要适当的代谢组覆盖，这反过来要求非常高端分析仪器．在一起,质谱分析而且核磁共振是世界上最合适的技术。信息学是代谢组学的第三个重要组成部分。

代谢组学服务分为两大类，即“分析”和“稳定同位素分解代谢组学”(SIRM)。分析是指有目标或无目标的实验设计，以确定分析平台(如不同类型的质谱或核磁共振)中特征的数量或样品中化合物的身份和数量。

SIRM是指通过生物化学转化为各种中间体和产物，从稳定的富同位素源分子中追踪单个原子，以进行路径分析和通量测量^{1 - 9}．

一般来说，代谢源的选择决定了被探测的生化网络。下面列出的是数千个可能的探测中的几个:

• (U -¹³C]葡萄糖:调查¹³C进入氨基酸、核苷酸、脂类(糖酵解、PPP、CAC)、己糖胺
• ¹³C₁，¹³C₂-Glc:区分戊糖磷酸途径的氧化分支和非氧化分支;电脑回补
• ¹³C¹⁵N Gln:谷氨酰胺水解，核苷酸生物合成，能量代谢(CAC)， FA生物合成
• ¹³C - FA: b-氧化，FA生物合成
• ¹³C Ser:丝氨酸代谢;1 - c代谢;脂质代谢
• ¹³丙三醇:脂质主干生物合成

可用的分析平台包括高分辨率核磁共振，高分辨率(>40万)高质量精度质谱(直接输液或LC)， GC-MS。这些平台提供了有关代谢物的数量和性质以及中枢代谢过程中所涉及的途径和网络的信息，这些信息可通过结合同位素和同位素分析的示踪实验进行探测¹³C /¹⁵N丰富前体^{1 - 9}：

1.好氧糖酵解:NAD+将葡萄糖氧化为丙酮酸

2.乳酸发酵:将丙酮酸还原为乳酸

3.葡萄糖消耗的速率归一化，以测量细胞数量或体积

4.消耗的葡萄糖转化为排泄乳酸的部分

5.从13C来源(如葡萄糖、谷氨酰胺等)排出的乳酸的部分富集

6.游离NAD+、NADH的定量

7.戊糖磷酸途径:区分氧化(NADPH产生)和非氧化分支-在核糖核酸池中合成核糖

8.肝糖分解

9.来自3PGA的丝氨酸/甘氨酸途径

10.由乳酸或其他生糖前体产生的糖异生

11.克雷布斯循环和无反应(包括PC、典型和非典型谷氨酰胺水解)

12.除谷氨酰胺分解外的氨基酸氧化(如丝氨酸分解、支链氨基酸氧化成TCA、GDH等)

13.核苷酸合成-嘌呤和嘧啶途径

14.脂肪酸氧化

15.脂质合成和翻转(来自DHAP的酰基链和甘油头基)-大多数主要脂类中同位素分布的分析，>500种

16.己醣胺通路

17.GSH合成和氧化- GSSH/GSSG/GR循环

18.脂质过氧化作用

一般来说，在一个嵌入式网络中，每条路径都没有单一的标记物，而是需要多个同位素/同位素的组合来进行明确的分配。

特定的同位素分布也使(在某些情况下)能够区分发生在不同腔室中的相同生化反应。

包括脂类在内的命名分子总数为>700。包括同位素和同位素有几千个。

采用了为SIRM应用量身定制的最先进的质谱和核磁共振光谱仪。

有用的代谢组学的链接

• 代谢组学手册:http://www.springer.com/us/book/9781617796173
• 代谢组学社会:http://metabolomicssociety.org/

D. Allan Butterfield，博士，氧化还原代谢共享资源设施主任

dabcns@uky.edu；859-323-1106
巴特菲尔德博士是英国校友会生物化学特聘教授。他的专长是自由基检测、氧化应激测量和氧化修饰蛋白的蛋白质组学鉴定。

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Richard Higashi，博士，RM SRF代谢组学副主任，稳定同位素分解代谢组学(RC-SIRM)资源中心主任

rick.higashi@uky.edu；859-218-1027
Higashi博士，毒理学和癌症生物学教授，是质谱专家，识别和量化在癌症中重要的代谢物。

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Tomoko Sengoku，博士，RM SRF的运营经理

Sengoku博士参与RM SRF的所有方面，并将通过RM SRF服务提供指导。

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Michael Alstott, MS，研究设施经理

michael.alstott@uky.edu；859-323-1106
Alstott先生协助日常实验室操作的各个方面，包括氧化应激和海马分析。他还向主任和RM SRF服务用户提供实验性行政协助。